Диагностика микозов: микроскопия, бактериологический посев, гистология

Для диагностики микозов могут быть использованы микроскопические, микологические (культуральные), аллергические, серологические, биологические и гистологические методы исследования. В зависимости от патогенеза материалом для исследования могут быть гной, мокрота, пораженные волосы, ногти, чешуйки кожи, пунктаты костного мозга, лимфатических узлов, внутренних органов, кровь, желчь, испражнения, биоптаты тканей и т. п.

Микроскопическое исследование включает микроскопию на-тивных (неокрашенных) и окрашенных мазков. Для приготовления нативных препаратов волосы, соскобы кожи, ногтей просветляют в 10.30 % растворах КОН или NaOH. Обработанный щелочью материал помещают на предметное стекло в каплю глицерина, накрывают покровным стеклом и микроскопируют (можно использовать фазово-контрастную микроскопию), что дает возможность изучить строение гриба, расположение спор, но окончательное заключение о видовой принадлежности гриба можно сделать только после культуральных исследований.

Для окраски мазков чаще всего используют методы Грама, Циля.Нильсена, Романовского-Гимзы. Для окраски дерматофитов применяют также методы Сабуро, Адамсона и др.

Культуральное (микологическое) исследование проводят для выделения чистой культуры гриба и ее идентификации. Используют плотные и жидкие питательные среды (Сабуро, сусло-агар, Чапека и др.). Инкубация в термостате (22.28ºС) длительная (3.4 нед). Чистую культуру гриба идентифицируют по совокупности признаков: форме колоний, их цвету, консистенции, микроскопической картине (характер мицелия, расположение спор, конидиеносцев) и другим признакам.Серологические реакции для диагностики грибковых заболеваний проводят с грибковыми антигенами по общепринятым методикам, как и для диагностики других инфекционных заболеваний (РА, РП, РСК, РНГА, РИФ и др.).

Аллергические пробы можно проводить по общепринятым методикам внутрикожным введением соответствующих аллергенов (полисахаридные и белковые фракции из клеток или клеточных оболочек, взвесь клеток убитых грибов, фильтраты культур). Для выявления ГНТ можно использовать тест дегрануляции тканевых и сывороточных базофилов, а для выявления ГЗТ – реакции торможения миграции фагоцитов, бластной трансформации лимфоцитов.

Биологическое исследование проводят на лабораторных моделях (мыши, крысы, морские свинки, кролики, собаки, кошки). Биологическую модель микоза используют для выявления патогенности возбудителя, выделения чистой культуры, изучения новых антимикотиков. Гистологическое исследование дает возможность обнаружить гриб в тканях, изучить его морфологию и особенности патологического процесса, вызванного им в организме.

37.1.218.108 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)

очень нужно

Методы диагностики микозов

Забор материала со свежих развившихся поражений, где больше элементов гриба. Пораженные волосы берутся эпиляционным пинцетом. Элементы гладкой кожи, чешуйки — скальпелем. При поражении ногтей — соскоб скальпелем или отрезается кусочек маникюрными ножницами. Соскобы со слизистой оболочки берутся шпателем. Все остальные материалы — как обычно (при бактериологическом исследовании).

Микроскопическое исследование

Исследуют: — неокрашенные (нативные) окрашенные препараты. Предварительно материал просветляется. Для этого материал обрабатывают щелочью (10-30%) в течение 20 минут. Можно также производить просветление материала разведением в физрастворе. Чтобы сконцентрировать материал, его центрифугируют.

Нативные препараты. Каплю материала наносят на предметное стекло, затем добавляют раствор Люголя и спиртовой раствор глицерина (по 50% каждого). Накрывают покровным стеклом и исследуют в фазовоконтрастном или световом микроскопе.

Окрашенные препараты готовят обычным способом, окрашивают по Граму, ЦильНильсену, Романовскому-Гимзе и специальными методами. Фиксация — только жидким фиксатором.

Большинство питательных сред для грибов готовится на основе среды Сабуро (водо-проводная вода + агар-агар + пептон + мальтоза).

Экспериментальный метод применяется для оценки патогенности выделенного гриба-возбудителя. При заражении используют чистые культуры или патологический материал. Подбор животных, техника введения материала, этапы работы — такие же, как в бактериологии.

Иммунологические исследования . (серологический и аллергический методы) — такие же, как в бактериологии.

Гистологическое исследование. — такое же, как в бактериологии (мазки-отпечатки, срезы), но изучают не только морфологию гриба, но и реакцию ткани на возбудителя, глубину поражения.

Лабораторная диагностика поверхностных микозов (кератомикозов, дерматомикозов)

1. Микроскопия патологического материала.

2. Выделение чистой культуры гриба и идентификация по морфологии.

Лабораторная диагностика кандидомикоза.

1. Микроскопия патологического материала.

3. Серологический метод: используется РСК и РА (диагностический титр антител 1:160) и РПГА (1:1600). Ставят также РП с белковыми и полисахаридными антигенами кандид.

4. Аллергический метод (кожные пробы по типу реакции Манту).

5. Выделенная культура проверяется на вирулентность на белых мышах. Если доза до 1 млн. клеток кандид вызывает гибель мыши, культура считается вирулентной.

Лабораторная диагностика глубоких микозов.

1. Микроскопия патологического материала.

2. Выделение чистой культуры.

3. Серологическая диагностика (РА, РП, РСК, РПГА). Эти реакции редко бывают положительными.

4. Выявление криптококкового антигена в крови и ликворе больных с помощью РП.

5. Заражение белых мышей.

1. Микроскопия патологического материала.

2. Выделение чистой культуры.

3. Серологическая диагностика:

с 2 недель до 4 месяцев выявляют антитела в РП,

с 4 месяцев и позже ставят РСК (диагностические титры 1:4 — 1:32).

1. Микроскопия патологического материала.

2. Выделение чистой культуры.

3. Серологическая диагностика: первые три месяца в РСК и РП выявляются анти-h-антитела (это острый процесс). Позже 3 месяцев в РСК и РА выявляют анти-m-антитела (хронический процесс).

4. Кожная проба с гистоплазмином.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Посев на грибы — диагностика грибковых инфекций (микозов)

«Посев на грибы», «посев на лишай», «посев на грибок» — под этими не вполне научными терминами понимают культуральное микологическое исследование, т.е. выделение культур патогенных грибов на питательных средах. Если бактериологический посев (бакпосев) – довольно распространенный анализ, проводимый во многих лабораториях, то грамотное микологическое исследование могут провести далеко не везде. В чем же состоит специфика «посева на грибок»? Зачем проводить посев, если почти в любой ветклинике могут провести микроскопию и в течение дня (а то и часа) сказать, обнаружен грибок или нет?

Это интересно:  Биорезонансная диагностика паразитов

Начнем со второго вопроса. Зачем делать посев, если можно сделать микроскопию (быстрее и дешевле?). Прежде всего заметим, что разница в цене не такая уж существенная. Например, если в одной лаборатории за 600 руб. проводят «микроскопию на грибы», то в другой лаборатории за 700 руб. можно провести полноценное микологическое исследование, которое включает и микроскопию, и выделение культуры гриба (посев), и его определение чувствительности к противогрибковым препаратам (антимикотикам).

Довольно длительный срок анализа компенсируется рядом бесспорных преимуществ по сравнению с микроскопией. Прежде всего точность результатов (чувствительность метода) – при микроскопии она составляет не более 40%, при посеве – 70-90% (заметим, что 100% чувствительность не гарантирует ни один метод классической микробиологии). Иными словами вероятность обнаружения гриба гораздо выше при культуральном анализе (посеве), чем при микроскопии.

Какие грибы можно обнаружить при микроскопии? Квалифицированный опытный миколог (специалист по грибам) может обнаружить самые разные виды патогенных грибов, используя соответствующие методы. Однако в большинстве случаев вам дадут ответ только в отношении грибов-дерматофитов (возбудителей «стригущего лишая»). Многие ветклиники так и указывают в прейскурантах – «микроскопия шерсти на дерматофиты». Такой анализ заключается в том, чтобы попытаться найти характерные «мозаичные споры» вокруг волоса или внутри его, как на картинке, знакомой ветеринарам со студенческой скамьи. При этом все остальные возможные грибковые возбудители остаются за бортом. Смысл такого анализа довольно сомнителен. Особенно в настоящее время, когда большинство микозов вызывается грибами-оппортунистами – обширной группой, насчитывающей десятки видов. Кроме того даже у животного с заведомым диагнозом «дерматофитоз», найти волосы с классическими артроспорами получается далеко не всегда.

Итак, посев, в отличии от микроскопии, обладает большей точностью, и позволяет выявить разные виды грибов, определить их вид, т.е. поставить точный диагноз. Грибковая инфекция может быть вызвана не одним, а ассоциацией 2-х и более видов грибов, что можно установить только при культуральном анализе. Подробнее о преимуществах микробиологического посева перед экспресс-методами диагностики.

У культуры гриба-возбудителя определяют чувствительность к набору антимикотиков. Современные грибковые возбудители (грибы-оппортунисты, эмерджентные патогены ) варьируют как по видовому составу, так и по степени чувствительности к антмикотикам. Поэтому целесообразно определять чувствительность в каждом конкретном случае, что позволит выбрать оптимальное средство терапии грибковой инфекции.

Микологическое исследование имеет специфические отличия от бакпосева на всех этапах – начиная от отбора проб и заканчивая интерпретацией результатов анализов. Если для бакпосева материал из очага отбирают обычно мазком на ватный тампон, то для микологии необходимо собрать волосы с корнями, а также чешуйки, корочки в стерильный контейнер для лабораторных образцов (подробнее см. Правила отбора патматериала). Существует специфика отбора проб из разных локусов и при подозрении на разные возбудители.

Микологический посев существенно отличается от бактериологического – как методически, так и по питательным средам. Бактериологические среды для выделения грибов не подходят. Существует распространенное мнение, что все грибы растут на среде Сабуро. Действительно, большинство грибов способно к росту на этой среде, однако выделить культуру – еще не значит выделить возбудителя. Кожный покров животных контаминирован большим количеством спор микроорганизмов, в т.ч. безвредных грибов-сапротрофов. В микологических лабораториях наряду со средой общего назначения (Сабуро, сусло-агар) используют еще ряд селективных питательных сред различного назначения: для ингибирования бактериальной флоры и выделения дрожжей и плесеней, для выделения грибов-дерматофитов, для выделения липофильных грибов, для выделения актиномицетов и т.д. Только таким образом можно получить достоверное представление о «микологическом пейзаже» в очаге патологического процесса.

В этом контексте очевидно, что использование хромогенных сред для диагностики дерматофитозов (DTM) имеет смысл только в наборе с другими средами, в противном случае не будут выявлены остальные патогенные грибы. Однако даже для выделения дерматофитов данная среда не является оптимальным вариантом, особенно если персонал не знаком с азами микологии.

Следующий этап – интерпретация клинической значимости обнаруженных грибов. Это очень важный момент, т.к. выделение какой-либо культуры гриба еще не говорит о ее этиологической роли (это касается прежде всего грибов-оппортунистов). Например, выделенный из кожного поражения у собаки вид Aspergillus fumigatus вполне может оказаться контаминантом, и назначать животному противогрибковую терапию бессмысленно. Поэтому специалисты-микологи используют специфические критерии, позволяющие судить о клинической значимости обнаруженного гриба (критерии Волша-Инглиша).

По этой же причине применение ПЦР-методов в ветеринарной микологии пока очень ограничено. ПЦР позволяет с высокой точностью обнаружить в материале клетки грибов, однако как интерпретировать их роль – это задача квалифицированного миколога.

Итак, резюмируем изложенное. 1. «Посев на грибы» (микологический анализ) – специализированное диагностическое исследование, проводимое в профильных микологических лабораториях; 2. По сравнению с микроскопией, микологический посев гораздо точнее и информативнее; 3. Только при посеве можно выделить культуру гриба и определить ее чувствительность к противогрибковым препаратам; 4. Посев позволяет не только обнаружить болезнетворные грибы, но и достоверно интерпретировать их клиническую значимость.

Это интересно:  ВРТ диагностика: в каких случаях можно проводить

В заключении отметим, что при подозрении на инфекционное заболевание наибольшей диагностической ценностью и информативностью обладает комплексное микробиологические исследование (микология + бактериология).

Диагностика микозов: микроскопия, бактериологический посев, гистология

При культуральном исследовании диагностически значимымявляются:

— выделение плесневого или дрожжевого гриба, при исследовании стерильного в норме материала;

— выделение диморфного гриба.

Алгоритм микологического исследования

1. Определение грибковой этиологии возбудителя (микроскопия).

2. Определяют дрожжевой гриб или плесневый:

— микроскопия клинического материала (наличия мицеллия);

— характер колоний на питательной среде, скорость роста (дрожжевые грибы растут 48 часов, плесневые грибы растут медленно).

3. Окончательную идентификацию гриба до уровня вида (внутривидовая) проводят с использованием биохимических тестов и иммунологических методов. При исследовании биохимических свойств изучают способность выделенной культуры к ассимиляции (ауксанограмма) и ферментации (зигограмма). Возможно использование автоматизированных систем идентификации (тест-системы для идентификации грибов).

Критерии этиологической значимости выделения условно-патогенных грибов

1.Если в нативном препарате видны только бластоспоры (сапрофитная вегетация) то это расценивается как носительство.

2.Если в нативном препарате преобладают бластоспоры и появляются единичные нити псевдомицелия, то это сигнал о переходе гриба к паразитизму.

3.Если бластоспоры единичные и преобладает псевдомицелий, то это признак глубоких органных поражений.

4.Активное почкование бластоспор – свидетельство острого процесса.

5.Количественную оценку результатов – выделение гриба из разведений

-10 -фекалии , моча;

6.Повторность высеваемости одного и тогоже вида гриба

7. Наличие антител к выделенному штамму.

Микологическое исследование отделяемого слизистых

1. Подготовка материала. После забора материала со слизистых тампон помещают в 2 мл жидкой среды Сабуро или сусло-агара, или МПБ, разлитого в стерильные пробирки. Их тщательно встряхивают в течение 5 минут, стараясь не замочить пробку. Из полученной взвеси готовят ряд разведений 1:10 и 1:100 и т.д.

2. Культуральное исследование.

Из каждого разведения высевают по 0,1мл на 2 чашки сусло-агара, агара Сабуро или МПА. Посевы на плотных средах и пробирку с жидкой средой с тампоном для обогащения инкубируют при +37 0 С в течение 48 часов:

— после пройденного времени посевы просматривают и подсчитывают число колоний и ориентировочно определяют количество дрожжевых колоний. Их количество умножают на 20 и на разведение, из которого сделан высев;

— если на чашках с посевом, сделанным из разведений роста нет, то делают повторный посев из среды обогащения в чашку с сусло-агаром.

Микологическое исследование крови

1. Подготовка материала. После забора крови ее разводят 1:10, для того, чтобы бактерицидные свойства крови не ингибировали рост грибов.

2. Культуральное исследование.

— через 5 дней делают контрольный высев. Для этого стерильной пипеткой забирают осадок 3-4 капли из пипетки засевают на сусло-агар и растирают стерильной бактериологической петлей;

— засеянные чашки в течение 2-5 дней держат в термостате при 37 0 С;

— если обнаружен рост, то выдают предварительный ответ о фунгемии, а дальнейшую идентификацию гриба проводят в ходе исследования.

Микологическое исследование биоптатов

1.Для забора материала используют метод отпечатков.

2. Культуральное исследование:

— делают отпечаток исследуемым кусочком ткани на поверхность плотной питательной среды Сабуро;

— этот же кусочек ткани помещают в 50мл жидкой питательной среды (сусло или Сабуро);

— посевы инкубируют при 37 0 С в течение 5 дней.

Микроскопическая диагностика микозов

Лаборатория для работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности укомплектовывается легко дезинфицирующейся мебелью, включая шкафы для чистой лабораторной посуды, реактивов, питательных сред, соответствующим оборудованием и инструментами. Для работы необходимы спиртовки или газовые горелки, микробиологические петли, микологические лопаточки, шпатели, эпиляционные и анатомические пинцеты, кусачки маникюрные, скальпели, ножницы, ложечки Фолькмана, пипетки, пастеровские пипетки, иглы препаровальные, стеклянные палочки, шприцы, низкоскоростная центрифуга, аппарат для встряхивания, чашки Петри, пробирки, стеклянная посуда, ультрафиолетовая лампа Вуда с фильтром, микроскопы, осветители, термостаты, автоклавы, холодильники, сухожаровые шкафы, бактерицидные лампы.

Взятие материала для исследования

Микроскопическая диагностика микозов подразумевает обнаружение мицелия и спор в исследуемом биоматериале. В качестве исследуемого биоматериала рассматриваются чешуйки эпидермиса, волосы и ногти. Непременным требованием перед проведением исследования является отсутствие местного лечения в течение, как минимум, десяти дней и системного лечения – в течение месяца. Следует иметь в виду, что использование пациентом моющих средств (особенно содержащих антисептики) способно повлиять на достоверность результатов исследования, поэтому за 3-4 дня до его проведения запрещают мытьё.

Инструментарий для взятия биоматериала и приготовления препарата представлен на рисунке:

Фото. Инструментарий для взятия биоматериала и приготовления препарата.

При подозрении на микоз гладкой кожи, микоз кистей и стоп без поражения ногтевых пластинок исследуются чешуйки эпидермиса с поверхности очага поражения. При микозе гладкой кожи является предпочтительным исследование эпидермиса с краевой зоны очага поражения, так как в центральной зоне патологический процесс нередко разрешается. При этом не следует забывать о возможности поражения пушковых волос, что определяет выбор дальнейшей тактики лечения. Волосы извлекают эпиляционным пинцетом. При микозе кистей и стоп без поражения ногтевых пластинок исследуются чешуйки эпидермиса из третьей и четвертой межпальцевых складок, а также с ладоней и со свода стоп.

При подозрении на грибковое поражение длинных волос (волосистой части головы, бороды, усов и лобка), а также пушковых волос выполняется их микроскопическое исследование. При трихофитии волосистой части головы волосы обламываются на расстоянии 1-2 мм над уровнем устья волосяного фолликула, напоминая при этом пеньки и точки. Если волос не удаётся захватить эпиляционным пинцетом, то в этом случае его стараются извлечь острым концом скальпеля или препаровальной иглой.

Это интересно:  Диагностика чесотки: как распознать, что делать при обнаружении

При микроспории волосистой части головы волосы обламываются на высоте 5-6 мм, напоминая «скошенный луг». При микроскопии исследуются именно эти обломанные волосы. Волосы из очагов поражения извлекают с помощью пинцета.

При фавусе исследуют истончённые волосы над поверхностью скутулы.

При подозрении на онихомикоз исследуется легко измельчающийся материал из зоны подногтевого гиперкератоза, а также сами измененные ногтевые пластинки.

Необходимо понимать, что любой исследуемый материал от пациента потенциально заразен, поэтому его взятие необходимо осуществлять в помещении, где осуществляется ежедневная влажная уборка с применением дезинфицирующих средств (5% раствор хлорамина, 5% осветленная хлорная известь), а воздух стерилизуется ультрафиолетовыми облучателями (их включают на 1-1,5 ч и входят в помещение через 20 мин после выключения). Термостаты еженедельно протирают 0,5% раствором хлорамина, стены обрабатывают дезсредствами 1 раз в месяц. Врач при работе должен быть защищён маской, защитными очками, халатом и перчатками. Инструментарий для взятия биоматериала, перчатки, предметные и покровные стёкла, одноразовые пелерины и салфетки обеззараживают после использования, погружая в 1,5% раствор клиндезина-экстра (5% раствор фенола или 5% раствор лизола) на 30 минут. Оставшийся патологический материал (волосы, кожные и ногтевые чешуйки) автоклавируют при 2 атм. и 132˚ С в течение 20 мин (контроль — мочевина) или при 1,5 атм. и 126˚ С в течение 30 мин (контроль — бензойная кислота), либо кипятят 1 час в воде или 30 мин в 1% мыльно-содовом растворе.

Патологический материал транспортируют в лабораторию в специальной таре или металлических биксах, защищая его от прямых солнечных лучей. В сопроводительном документе указывают фамилию, имя, отчество, пол, возраст и адрес больного, предполагаемый клинический диагноз, наименование исследуемого материала, время его взятия, локализацию очага, номер истории болезни, фамилию врача и учреждение, направляющее материал.

Приготовление препарата

После получения чешуек эпидермиса с очага поражения производится приготовление препарата для микроскопического исследования. На исследуемый материал, помещенный на предметное стекло, наносят 1-2 капли 20% КОН, после чего предметное стекло подогревают над пламенем горелки до появления белесоватого ободка кристаллизованной щелочи по периферии. Затем препарат накрывают покровным стеклом (которое придавливают препаровальной иглой) и микроскопируют. Исследование необходимо проводить не позднее 2-х часов после приготовления препарата из-за возможности кристаллизации щёлочи.

Способ приготовления препарата волоса при подозрении на его грибковое поражение соответствует ранее описанному, с той лишь разницей, что покровное стекло не придавливается препаровальной иглой (во избежание раздавливания волоса).

Фото. Появление ободка кристаллизованной щелочи.

Для приготовления препарата кусочки срезанных ногтевых пластинок опускают в пробирку с 20% КОН и экспонируют в термостате в течение 1 часа (t≈37˚C), а затем получившуюся желеобразную массу переносят на предметное стекло, накрывают покровным и исследуют под микроскопом.

В отличие от ногтевых пластинок образцы из легко измельчающегося материала зоны подногтевого гиперкератоза помещают на предметное стекло, на них наносят 1-2 капли 20% КОН, после чего предметное стекло подогревают над пламенем горелки до появления белесоватого ободка кристаллизованной щелочи по периферии (рис.65). Затем препарат накрывают покровным стеклом, которое осторожно придавливают препаровальной иглой, и исследуют под микроскопом.

Микроскопия препарата

Для проведения микроскопического исследования используют лабораторный микроскоп без применения иммерсии. Микроскопия чешуек эпидермиса, чешуек из зоны подногтевого гиперкератоза, а также растворенных ногтевых пластинок производится вначале на малом увеличении (×100), а при обнаружении нитей мицелия, напоминающих «карту рек» (железных дорог), объектив переводится на бȯльшее увеличение (×400). Мицелий на среднем увеличении напоминает причудливой формы стеклянные палочки, изменяющие степень преломления света при работе микровинтом микроскопа.

Микроскопия препарата волоса производится сразу на среднем увеличении (×200 или ×400). При трихофитии внутри волоса обнаруживаются крупные споры, расположенные рядами, тогда как при микроспории внутри волоса имеется множество мелких мозаично расположенных спор (отсюда термин «микроспория»). Иногда отмечают наличие чехлика снаружи волоса – это характерно для как трихофитии (вариант ectothrix, споры при этом крупные), так и для микроспории (в этом случае чехлик состоит из мелких спор). При микроскопии пораженных волос при фавусе, внутри волоса кроме скоплений спор круглой или многоугольной формы, обнаруживаются пузырьки воздуха и нити мицелия.

Препараты необходимо просмотреть не позднее 2 часов с момента их приготовления из-за возможности кристаллизации щелочи. Для повышения надежности диагностики следует сделать несколько препаратов (не менее двух) из одного очага поражения. Возможные ошибки при микроскопической диагностике микозов могут быть связаны как с некачественным приготовлением препаратов (перегревом над пламенем горелки, что сопровождается преждевременной кристаллизацией щелочи), а также с недостаточным опытом исследователя (когда за нити мицелия нередко принимают волокна ткани, случайно оказавшейся в препарате).

Статья написана по материалам сайтов: studopedia.ru, vikidalka.ru, bakposev-vet.ru, studfiles.net, logoderm.ru.

«

Помогла статья? Оцените её
1 Star2 Stars3 Stars4 Stars5 Stars
Загрузка...
Добавить комментарий